Capítulo 2.
Estudios genéticos y moleculares: técnicas, momentos de estudio e interpretación de resultados.
Autores: Dra. Ruth Stuckey, Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, Las Palmas; Dr. Gonzalo Carreño Gómez-Tarragona, Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid.
Introducción
La leucemia mieloide crónica (LMC) se caracteriza genéticamente por la presencia de la translocación cromosómica t(9;22)(q34;q11) que implica la formación del cromosoma Filadelfia (der22,t(9;22)(q34;q11) (Ph) que contiene el gen de fusión BCR::ABL11,2. La detección de los mismos es esencial al diagnóstico y durante el seguimiento para evaluar la respuesta al tratamiento3,4. Además, es necesario el estudio de mutaciones en el dominio tirosina cinasa (TKD) de ABL1 en presencia de fracaso al tratamiento. Por último, en los últimos años se ha empezado a estudiar el papel que tienen las mutaciones somáticas adicionales en el pronóstico de la enfermedad4.
En este capítulo se presentan las técnicas e interpretación de los resultados de los diferentes análisis genéticos (cariotipo, FISH -hibridación in situ fluorescente, RT-PCR cualitativa y cuantitativa, NGS), utilizados en los distintos momentos del seguimiento de los pacientes con LMC (figura 1). Estos estudios deben realizarse siempre que sea posible en laboratorios acreditados (por ejemplo, con la ISO15189) y con controles de calidad externos apropiados4.
| Dianóstico | Seguimiento | Fallo a tratamiento | Crisis Blástica |
– Cariotipo. – RT-PCR con identificación de tipo de transcrito. – FISH. – RT-PCR cuantitativa. |
– RT-PCR cuantitativa.
– FISH (si no hubiese RT-PCR disponible). |
– Muraciones en el dominio cinasa de ABL1.
– Cariotipo.
|
– Mutaciones en el dominio cinasa de ABL1. – Cariotipo. – Panel mieloide / linfoide. |
Figura 1. Estudios genéticos y moleculares en Leucemia Mielode Crónica. FISH: hidratación in situ fluorescente, RT-PCR: quantitative polymerase chain reaction, TKD: dominio tirosina cinasa, VAF: francción de variantes alélicas. |
|||
Diagnóstico
El diagnóstico de la LMC requiere la detección de la t(9;22)(q34;q11) y/o del reordenamiento del BCR::ABL1 en el contexto clínico y de laboratorio adecuado1,2. Además, de cara al pronóstico y seguimiento de los pacientes, es necesario identificar o descartar la presencia de alteraciones citogenéticas adicionales (ACAs) y determinar el tipo de transcrito BCR::ABL1 que presenta el paciente4. En cualquier caso, no hay que olvidar que BCR::ABL1 también puede observarse en hasta el 30% de las leucemias agudas linfoblásticas (LAL) y en la leucemia mieloblástica aguda (LMA), aunque con baja frecuencia (<2%)1,2,5.
Citogenética
La citogenética convencional, que permite la identificación del cromosoma Filadelfia, sigue siendo obligatoria en los pacientes con LMC de nuevo diagnóstico3,4. Esta alteración cromosómica está presente en el 90-95% de los pacientes con LMC. El 5-10% de los casos pueden presentar translocaciones variantes en las que puede participar otros cromosomas o bien un reordenamiento críptico (no visible en el análisis convencional), todo ello sin valor pronóstico4. En tales casos, el gen de fusión BCR::ABL1 está siempre presente y es detectable por FISH o RT-PCR. Hay que recordar que se deben estudiar al menos 20 metafases y que la identificación de un clon tumoral requiere la presencia de una anomalía estructural, en este caso la t(9;22), en al menos 2 metafases4.
En algunos pacientes (en torno a un 7% en fase crónica) pueden aparecer anomalías citogenéticas adicionales (ACAs) en el clon Ph+ (ACA/Ph+), en el momento del diagnóstico6. Su detección es importante, ya que son un factor de riesgo adverso. La detección ACAs de alto riesgo (tabla 1) en el momento del diagnóstico predice peor respuesta a los inhibidores de tirosina cinasa (ITC), y permite identificar a pacientes con mayor riesgo de progresión de la enfermedad6,7,8. De hecho, la clasificación de consenso internacional (ICC), que mantiene el criterio de fase acelerada de la LMC, considera la presencia de ACA de alto riesgo como un criterio de la misma2.
| Tabla 1. Alteraciones citogenéticas adicionales de alto riesgo. | |||||
|
Trisomías: +8, +17, +19, +21 Cromosoma Philadelphia Extra (+Ph) i(17q) -7/-7q Alteraciones en las regiones 3q26.2 o 11q23 Cariotipo complejo |
|||||
La FISH, que en ningún caso debe sustituir al estudio de un cariotipo completo, puede resultar útil para la identificación de fusiones BCR::ABL1 crípticas por citogenética convencional y para identificar el reordenamiento en muestras en las que el cariotipo de bandas ha resultado no valorable4. Su uso tiene la ventaja de dar un resultado positivo independientemente del tipo de reordenamiento y, por lo tanto, puede resultar de ayuda cuando los resultados del cariotipo y RT-PCR son discordantes, aunque la RT-PCR sigue siendo imprescindible al diagnóstico para identificar el tipo de transcrito4.
RT-PCR
El transcrito de BCR::ABL1 debe ser identificado siempre al diagnóstico para poder hacer un seguimiento adecuado de la enfermedad3. Aunque hay descritos numerosos puntos de rotura, especialmente en el locus de ABL1, los más frecuentes son el e13a2 y el e14a2 (antiguamente llamados b2a2 y b3a2) que codifican una proteína de 210kD (p210) y representan el 98% de los casos. El otro 2% expresan fusiones atípicas de BCR::ABL1, de las cuales las más frecuentes son e1a2 (p190) y e19a2 (p230) (figura 2)4,9. Aunque se ha especulado mucho sobre el pronóstico adverso que presentan de los casos de LMC con transcritos atípicos, especialmente el p190, los resultados no son concluyentes, por lo que la decisión de iniciar el tratamiento con un ITC de segunda generación debe ser individualizada4,10.
En cuanto a la técnica empleada, se recomienda que sea capaz de identificar el tipo de transcrito antes de iniciar el tratamiento para poder hacer un seguimiento adecuado, siendo opcional la realización de la PCR cuantitativa (PCR)4. Aquellos centros que solamente determinen p210, p190 o p230 deben especificar en su informe que no se puede descartar la presencia de transcritos atípicos y deberán apoyarse en los resultados de cariotipo o FISH4. Cabe recordar que el seguimiento de los transcritos atípicos no se encuentra estandarizado y que en el caso de no disponer de una RT-PCR específica de seguimiento será necesario hacerlo por técnicas de citogenética4.
NGS
Aproximadamente un 30% de casos de LMC en fase crónica presentan variantes adicionales en genes relacionados con el cáncer (ASXL1 es el más frecuente, seguido de RUNX1, TET2 o DNMT3A)11,12,13. La presencia de estas mutaciones adicionales, especialmente en el caso de ASXL1, parece asociarse a peores resultados. A pesar de ello, todavía no está recomendada la realización del panel en práctica clínica, dado que sus resultados no cambian el manejo terapéutico. Es probable que esto cambie en un futuro próximo cuando se genere mayor evidencia sobre su papel en la respuesta a los distintos ITC4.
 |
Las flechas azules indican los puntos de rotura más frecuentes (5′ de exón de ABL1 y entre los exones 13 y 15 de BCR, que dan lugar a las fusiones de ARNm e13a2 y/o e14a2 BCR::ABL1 (p210). Las flechas rojas indican los puntos de rotura recurrentes en las variantes atípicas (e1e2, e6a2, e8a2, e19a2, e13a3, e14a3), aunque existen otras variantes. Los diagramas son ilustrativos y no están a escala. Imagen extraída de Cross NCP, et al. Leukemia 2023, bajo una licencia de Creative Commons CC BY. |
Seguimiento
La monitorización de los niveles de BCR::ABL1 por RT-PCR cuantitativa se estableció hace ya décadas14. Es importante recordar que los niveles de mRNA de BCR::ABL1 en leucocitos totales de sangre periférica representan bien la carga de la enfermedad y por lo tanto la respuesta al tratamiento (tabla 2)3,4. Debido a esto, el estudio del cariotipo ha quedado sustituido por la PCR cuantitativa (salvo en casos de recaída/progresión) y la FISH queda restringida a aquellos casos con transcritos atípicos en los que no se dispone de PCR. En cuanto los genes controles a utilizar, se consideran válidos ABL1, GUSB y BCR, aunque la mayoría de laboratorios utilizan el primero4,15. Por último, en los últimos años se está extendiendo el uso de la PCR digital, la cual es igual de válida que la PCR cuantitativa tradicional16.
| Tabla 2. Criterios de respuesta según la ELN 2020. | |||
| Óptima | Alarma | Fallo | |
| Basal | – | Alto riesgo por ELTS o ACA de alto riesgo | – |
| 3 meses | BCR-ABL115≤10% | BCR-ABL115>10% | BCR-ABL115>10% confirmada en 1-3 meses |
| 6 meses | BCR-ABL115≤1% | BCR-ABL115>1-10% | BCR-ABL115>10% |
| 12 meses | BCR-ABL115≤0,1% | BCR-ABL115>0,1-1% | BCR-ABL115>1% |
| Tras el diagnóstico, en cualquier momento | BCR-ABL115≤0,1% | BCR-ABL115>0,1-1% Pérdida de RMM (≤0,1%)* |
BCR-ABL115>1% o mutaciones de resistencia o ACA de alto riesgo |
ACA: alteración citogenética adicional. ELN: European LeukemiaNet. ELTS: Eutos Long-Term Survival; *Pérdida de respuesta molecular mayor (RMM) significa fracaso de tratamiento tras la discontinuación del ITC. |
|||
La escala internacional de medida de BCR::ABL1
En presencia de transcritos p210 (e13a2 y e14a2) los niveles de enfermedad deben expresarse en función de la Escala internacional (IS) que se define como el porcentaje de BCR::ABL1/gen control relativo a un estándar utilizado en el ensayo clínico IRIS18. Es este valor el que define la profundidad de la respuesta (en función de la reducción logarítmica) y permite establecer los criterios de la misma a lo largo del tiempo (tablas 2 y 3)4,17. Se considera que una respuesta molecular grado 2 (MR2) equivale a una respuesta citogenética completa y que la respuesta molecular profunda se presenta a partir de MR44,17.
Es importante señalar que los informes deben incluir no solamente el número de copias de BCR::ABL1 y BCR::ABL1/ABLIS si no también el número de copias del gen control, lo que es fundamental para determinar la sensibilidad de la técnica en esa muestra (tabla 3)4,17,18. Esto hace que los resultados obtenidos con tecnologías como la de GenXpert® deban ser confirmados por técnicas manuales antes de tomar decisiones terapéuticas, dado que a pesar de que es una metodología automática de gran utilidad no es tan fiable cuando los niveles de BCR::ABL1 son elevados ni da número de copias de ABL14,19,20.
| Tabla 3. Definiciones de respuesta molecular y número de transcritos mínimos de genes de referencia para poder evaluar la respuesta. | |
| Grado de respuesta | Nivel de transcrito y número mínimo de transcritos requeridos |
| Respuesta molecular mayor (RMM) | BCR::ABL15 ≤0,1% con nº copias ABL1≥10.000 o ≥24.000 GUSB |
| Respuesta molecular grado 4 (RM4) | BCR::ABL15 detectable ≤0,01% BCR::ABL15 no detectable con nº de copias ABL1≥10.000 o ≥24.000 GUSB |
| Respuesta molecular grado 4.5 (RM4,5) | BCR::ABL15 detectable ≤0,0032% BCR::ABL15 no detectable con nº de copias ABL1≥32.000 o ≥77.000 GUSB |
Respuesta molecular grado 5 (RM5) |
BCR::ABL15 detectable ≤0,001% BCR::ABL15 no detectable con nº de copias ABL1≥100.000 o ≥240.000 GUSB |
Transcritos Atípicos
En aquellos casos en los que esté disponible, el seguimiento de los pacientes con transcritos distintos de e13a2 y e14a2 debería hacerse con RT-PCR cuantitativa o digital. En estos casos, el resultado no puede expresarse en la escala internacional y se recomienda evaluar la respuesta como respuesta molecular individual, es decir, en relación con los niveles de enfermedad al diagnóstico21. Se recomienda el uso de los mismos genes de referencia que los utilizados en la escala internacional (ABL1, GUSB y BCR), especialmente GUSB, el cual ayuda a asegurar la linealidad de las medidas con niveles altos de enfermedad. Los criterios para evaluar una respuesta molecular mayor (RMM) serán los mismos que los utilizados en la escala internacional4. Sin embargo, hay que destacar que en muchos casos los test de PCR no se encuentran disponibles y el seguimiento se debe hacer por FISH con mucha menos sensibilidad, y por tanto, no será adecuado a la hora de decidir una discontinuación4.
Velocidad de reducción de la enfermedad (halving time)
El número de días en los que los niveles de BCR::ABL1 tardan en reducirse a la mitad con respecto al diagnóstico, el llamado halving time, tiene valor pronóstico tanto para la respuesta temprana como para resultados a largo plazo, incluida la supervivencia libre de tratamiento22,23. A día de hoy no cambia el manejo terapéutico de los pacientes y no se recomienda su cálculo utilizando los valores de la escala internacional ya que ésta es menos exacta con valores por encima del 10% debido a las características de los genes control, especialmente ABL14.
Fracaso del tratamiento
La ELN define los criterios de fracaso al tratamiento teniendo en cuenta el grado de respuesta en diferentes momentos del tratamiento con ITC (tabla 2). También se considera fracaso la detección de mutaciones en el TKD de ABL1 que confieren resistencia, o la identificación de una ACA de alto riesgo en el clon Ph+ en cualquier momento3.
Las mutaciones en el TKD de ABL1 son la causa más frecuente y mejor conocida de fracaso al tratamiento con ITC. Se estima que aparecen en el 10-15% de los pacientes que reciben imatinib y en menos del 10% de los pacientes que reciben ITC de segunda generación3. Otros mecanismos de resistencia a los ITC incluyen la evolución clonal (ACA) y mecanismos independientes de BCR::ABL1. Por último, en los últimos años se ha estudiado el papel que tienen las mutaciones somáticas en el pronóstico de la enfermedad, lo que ha llevado a que se considere realizar la secuenciación de paneles implicados en patologías mieloides y/o linfoides ya indicados en crisis blástica (CB) de forma más precoz. Todos ellos se explicarán a continuación.
Estudio de mutaciones del dominio tirosina cinasa
Se recomienda el estudio de mutaciones en el TKD en todos los pacientes que:
– no logran alcanzar una respuesta óptima, o en aquellos que tienen una respuesta óptima de larga duración pero que pierden en cualquier momento la RMM3.
Su estudio es imprescindible cada vez que se considera un cambio de línea de tratamiento para detectar posibles mutaciones que confieran resistencia, ya que el tipo de mutación orientará hacia el uso del ITC más adecuado (tabla 4). El tratamiento con un ITC no adecuado (según su espectro de sensibilidad) puede implicar una expansión de clones resistentes, incluso con múltiples mutaciones y/o mutaciones compuestas24,25,26. Además, su detección se asocia con inestabilidad genómica y un mayor riesgo de progresión27.
Hasta la fecha, se han descrito más de 100 mutaciones, y siguen apareciendo nuevas con el empleo de nuevos ITC. La presencia de la mutación T315I confiere resistencia total a los ITC de primera y segunda generación (imatinib, dasatinib, nilotinib, y bosutinib); en cambio, ponatinib y asciminib sí tienen actividad frente a la misma. El diferente mecanismo de inhibición de asciminib le permite tener eficacia contra mutaciones resistentes a otros ITC aunque ya se han descrito mutaciones de resistencia específicas al mismo (tabla 4).
| Tabla 4. Detección de mutaciones comunes que confieren resistencia a los diferentes ITC. | |
| Tipo de ITC | Mutaciones que confieran resistencia |
| Imatinib | T315I G250E, Y253H, E255K/V, F317L, M351T, F359V, L 387M, H396R |
| Dasatinib | T315I, T315A V299L, F317C/I/V |
| Nilotinib | T315I Y253H, E255K/V, F359C/I/V |
| Bosutinib | T315I G250E, E255K, V299L, F317L (baja actividad) |
| Ponatinib | T315L/M T315I/G250E, T315I/255K, T315I/M351T* |
| Asciminib | G109D, P223S, A337T/V, G463S, P465S, V468F, I502L T315I/E255K, T315I/M351T, T315I/F359I, T315I/E453Q* |
A modo de ejemplo, si se detecta la mutación V299L, está contraindicado el uso de dasatinib o bosutinib. *Solo se listan las mutaciones compuestas descritas con ponatinib y asciminib; son numerosas las mutaciones compuestas que confieren a los otros ITC. |
|
Metodología
El método recomendado para el estudio de mutaciones es la NGS. El límite de detección de la técnica es superior al 0,1% de transcritos. No se recomienda el análisis de mutaciones en el TKD al diagnóstico en fase crónica, por no haber habido ninguna presión selectiva por parte de un ITC. Tampoco está indicado el estudio en casos de recaída tras la discontinuación de ITC.
El uso de la secuenciación Sanger es aceptable si no se tiene acceso a la NGS4. La NGS tiene las ventajas de detectar mutaciones de baja frecuencia con relevancia clínica, y cuantificarla (VAF), facilitando su seguimiento. Si se detecta una variante con baja VAF y significado clínico desconocido, la monitorización secuencial mediante NGS puede ser útil para observar si el clon se expande, ya que se espera que una variante que confiera una ventaja clonal y cause resistencia (y no un polimorfismo), se expanda si no se cambia el ITC.
El método de detección de mutaciones mediante secuenciación NGS es similar al de Sanger. La muestra de partida para la preparación de la librería es cDNA (se requiere 50 ng, como mínimo) y se sigue con la amplificación de la región completa del dominio cinasa mediante PCR y la preparación de la librería a partir del amplicón obtenido.
Se prefiere realizar una única ronda de PCR porque disminuye los errores de incorporación en la PCR y los de secuenciación. Sin embargo, se puede realizar una segunda ronda de amplificación a partir del primer amplicón como molde (PCR “nested” o anidada) para generar un amplicón que corresponde al TKD.
Se recomienda comprobar las variantes detectadas por la NGS en el visor Integrative Genomics Viewer (IGV, del Broad Institute, disponible en https://igv.org/), de acceso gratuito.
Interpretación de resultados
No existen guías actualizadas sobre cómo informar las mutaciones del TKD encontradas; las últimas disponibles se publicaron en 200928. Sin embargo, la ELN publicó algunas recomendaciones de laboratorio en el 20234, que incluyen:
– No informar mutaciones relevantes detectadas por NGS con una VAF <3%, salvo en el caso de T315I, dado su fuerte significado clínico.
- Confirmar mutaciones no descritas con una VAF <15% en una muestra independiente.
- Solo informar las variantes con una buena cobertura. El parámetro de la profundidad mínima de cobertura debe ser determinado en cada laboratorio, pero debe ser lo suficiente profundo para confiar en las variantes detectadas (mínimo de 25 lecturas del alelo alternativo).
- El informe debe reflejar el método usado y su límite de sensibilidad. En el caso de NGS, suele ser del 1-3%; con secuenciación Sanger es del 15-25%.
- No informar la inserción de 35 aminoácidos al final de exón 8, ya que su efecto es benigno29.
– Tener cuidado con el uso de los heat map para la interpretación de variantes. Muchos de ellos se basan en observaciones in vitro (IC50) y no en evidencia derivada de ensayos clínicos o estudios de pacientes que han desarrollado resistencia en la vida real.
Por último, aunque el informe del laboratorio puede recomendar un ITC eficaz contra la mutación específica detectada, es el clínico quien debe seleccionar el tratamiento más adecuado, teniendo en cuenta otros factores como las comorbilidades y factores de riesgo del paciente.
Mutaciones compuestas
La identificación de mutaciones compuestas (un clon con varias mutaciones) tiene una gran relevancia clínica por varios motivos: primero, su presencia está asociada a fases avanzadas de la enfermedad; segundo, las células con mutaciones compuestas requieren una dosis mucho más alta de ITC para su inhibición comparado con las mutaciones simples30. Por ejemplo, tanto la variante G250E como V299L son sensibles a dasatinib, pero la mutación compuesta G250E/V299L es muy resistente. Algunas mutaciones compuestas presentan incluso resistencia a ponatinib y asciminib. Por ejemplo, T315I/G250E y T315I/M351T confieren resistencia a ponatinib, mientras que T315I/M351T, T315I/F359I y T315I/E453Q son resistentes a asciminib. La mutación compuesta T315I/E255K tiene resistencia tanto a ponatinib como a asciminib31. Por lo tanto, la presencia de mutaciones compuestas limita significativamente las opciones terapéuticas. Es por este motivo que en ensayos clínicos, aleatorizados se están evaluando tratamientos combinados de asciminib con otro ITC, incluyendo ponatinib.
La detección de mutaciones compuestas es un reto importante para el laboratorio y depende de varios factores:
– La distancia entre las dos variantes.
– La longitud del amplicón.
– El tipo de secuenciación (por ejemplo, 2 x 300 pb o 2 x 150 pb).
Además, su cuantificación requiere el uso de UMIs (identificadores moleculares únicos), que actúan como “códigos de barra”, lo cual encarece el estudio. Debido a estas limitaciones, las nuevas modalidades de secuenciación de tercera generación de “lecturas largas” son alternativas muy prometedoras porque permiten secuenciar fragmentos de ADN más grandes, sin necesidad de fragmentar, lo que permite la identificación de mutaciones compuestas. Las principales tecnologías en este campo son Oxford Nanopore y Pacific Biosciences.
Cariotipo
La aparición de ACAs durante el tratamiento con ITC se conoce como evolución clonal. Se ha descrito la asociación de i(17q), −7/del(7q), y el reordenamiento del 3q26.2 con una respuesta no óptima al ITC, y se detectan ACA en el 45% de los casos resistentes a tratamiento con ITC32. Por lo tanto, se recomienda repetir el cariotipo en médula ósea si el paciente pierde la RMM o no logra una respuesta óptima. La aparición de ACAs durante el seguimiento (no presentes al diagnóstico) se considera un “fracaso” porque se trata de una evolución clonal. Aunque en hasta un 10% de los casos son transitorias, otras están claramente asociadas a un alto riesgo de progresión, como es el caso de la monosomía 7 o la del(7q)8; 33.
NGS
Como se ha mencionado, el 30% de los casos de LMC en fase crónica presentan variantes adicionales en genes relacionados con el cáncer (ASXL1 es el más frecuente, seguido de RUNX1, TET2, DNMT3A, BCOR o EZH2)34. La National Comprehensive Cancer Network (NCCN) recomienda considerar el uso de un panel de mutaciones mieloides mediante NGS en pacientes que no alcanzan una respuesta óptima y no tienen mutaciones identificables en el TKD de ABL1, con el fin de identificar mutaciones en genes que puedan conferir resistencia a los ITC35 aunque a día de hoy no hay tratamiento específico. Por ejemplo, se ha asociado una respuesta no óptima a imatinib con variantes en BCL2L11/BIM u otros factores epigenéticos,36,37 como ASXL1, IKZF1, DNMT3A, y CREBBP; además, mutaciones en TP53 se han relacionado con una peor respuesta a los ITC en general13.
La presencia de estas mutaciones adicionales en la fase crónica, especialmente en ASXL1, parece estar asociada con peores resultados34,38. Existe evidencia clara de que la acumulación de mutaciones somáticas es un marcador importante de progresión a fases avanzadas de la enfermedad39,40 y su detección precoz puede ayudar esta evolución. Sin embargo, aún no se recomienda realizar un estudio de panel de genes al diagnóstico, ya que los resultados no cambian el manejo terapéutico en la actualidad2.
Un 5-10% de pacientes con LMC muestran resistencia primaria a los ITC, incluso a los de segunda y tercera generación. Además de las mutaciones en el TKD, y la sobreexpresión de BCR::ABL1 en algunos casos, existen otros mecanismos de resistencia secundaria que son independientes de BCR::ABL1. Estos incluyen la activación de vías de señalización de cinasas de la familia Src41, así como de otras vías, como PI3K-mTOR y RAF-MEK-ERK, y NF-κB42. También se han identificado mecanismos que afectan el metabolismo del ITC y su concentración intracelular, como la acción de las enzimas del citocromo P450 y de proteínas transportadoras. En este sentido, se han descrito variantes en genes que codifican transportadores como ABCB1 (MDR1), ABCB2, y SLC22A1 (OCT1), todos transportadores de imatinib, los cuales influyen en la respuesta al fármaco43,44. Sin embargo, los laboratorios de referencia no suelen estudiar estos mecanismos de resistencia, ya que se consideran investigacionales y aún quedan muchos mecanismos de resistencia por determinar.
Crisis Blástica (CB)
Aunque el tratamiento con ITC ha mejorado significativamente el pronóstico de los pacientes con LMC en fase crónica, aproximadamente un 5% de ellos progresan a CB. Aún no está claro por qué algunos pacientes progresan a CB, mientras que otros permanecen en una FC estable durante muchos años. Predecir qué pacientes tienen riesgo de progresar a la CB representa un desafío clínico importante.
Ante sospecha de progresión a fases avanzadas, es necesario realizar un cariotipo de médula ósea, además del estudio de mutaciones del TKD. También se recomienda realizar la secuenciación de un panel de genes implicados en patologías mieloides o linfoides en caso de CB.
Mutaciones de TKD ABL1
Se detectan mutaciones en el dominio cinasa de ABL1 en hasta un 70-80% de los pacientes con LMC en CB45. Adicionalmente, se observa una mayor frecuencia de mutaciones compuestas en pacientes que progresan a CB46.
Ante la sospecha de progresión durante el tratamiento, debe realizarse el estudio de mutaciones TKD. También debe llevarse a cabo al diagnóstico si el paciente debuta CB para orientar el tratamiento (ver capítulo 7 para más información sobre el tratamiento de pacientes en fases avanzadas).
Cariotipo
Se detectan ACA en el 60-80% en los casos de CB y su aparición está asociada con la progresión a una fase más agresiva de la leucemia. Las ACAs suelen estar asociadas con el cromosoma Ph; sin embargo, también pueden incluir translocaciones de otros oncogenes conocidos, como MLL, CBFB, IKZF1 y PAX539. Entre ellas, las más frecuentes son la t(3;21) y t(7;11), que involucran a los genes RUNX1::MECOM y NUP98::HOXA9, respectivamente. En la mayoría de los casos, estas alteraciones son similares a las descritas en leucemias agudas y parecen ser específicas del fenotipo: la trisomía 8, el i(17q) y la hiperploidía suelen estar más asociadas con la CB mieloide, mientras que la hipoploidía o la pseudodiploidía se asocian más frecuentemente con la CB linfoide47. La presencia de dos o más ACAS también influye negativamente en el pronóstico34,40.
Siempre se realiza el cariotipo en casos de progresión a fases avanzadas.
NGS
Las recomendaciones de la NCCN destacan la importancia de realizar un panel mieloide en todos los pacientes con sospecha de progresión, dado que hasta un 80% de ellos presentan mutaciones somáticas relacionadas con cáncer35,48. Dependiendo de si se trata de una CB linfoide o mieloide, el perfil de mutaciones varía, siendo genes como IKZF1 y CDKN2A/B más prevalentes en CB linfoide, y genes como ASXL1 y TP53 en CB mieloide40. Por lo tanto, se recomienda el uso de paneles que incluyan genes asociados tanto a patologías tanto mieloides como linfoides, debido a la prevalencia de mutaciones en genes como BCOR, PAX5 e IKZF1, relevantes en CB.
La secuenciación de RNA (RNA-seq) o paneles dirigidos basados en ADN que cubren fusiones pueden aportar ventajas al identificar alteraciones genéticas relevantes, como deleciones de exones en los genes linfoides CDKN2A/2B, PAX5 e IKZF1. Es importante señalar que cualquier fusión novedosa o deleción detectada en un panel de RNA debe ser confirmada por una segunda técnica, como la FISH o amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples (MLPA), respectivamente.
Se ha observado una influencia negativa en la supervivencia de pacientes con mutaciones en ASXL1 y/o BCOR, y aquellos con ACA incluyendo i(17q), trisomía del cromosoma 21, y cariotipo complejo. Un modelo de estratificación pronóstica mostró que la acumulación de factores de mal pronóstico empeoraba de manera significativa la supervivencia de los pacientes. Además, los pacientes con mutaciones TP53 y del(17p), es decir los multihit, presentaron una supervicencia francamente peor40.
Aunque la accionabilidad de las mutaciones detectadas puede ser limitada, incluso en CB, su identificación sigue siendo relevante, especialmente en pacientes muy resistentes o en aquellos en los que no se han detectado mutaciones en TKD. En algunos casos podría ayudar a identificar tratamientos dirigidos, aunque principalmente en el contexto de ensayos clínicos.
Bibliografía
1. Khoury JD, Solary E, Abla O et al. (2022) The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours: Myeloid and Histiocytic/Dendritic Neoplasms. Leukemia 36, 1703-1719.
2. Arber DA, Orazi A, Hasserjian RP et al. (2022) International Consensus Classification of Myeloid Neoplasms and Acute Leukemias: integrating morphologic, clinical, and genomic data. Blood 140, 1200-1228.
3. Hochhaus A, Baccarani M, Silver RT et al. (2020) European LeukemiaNet 2020 recommendations for treating chronic myeloid leukemia. Leukemia 34, 966-984.
4. Cross NCP, Ernst T, Branford S et al. (2023) European LeukemiaNet laboratory recommendations for the diagnosis and management of chronic myeloid leukemia. Leukemia 37, 2150-2167.
5. Döhner H, Wei AH, Appelbaum FR et al. (2022) Diagnosis and management of AML in adults: 2022 recommendations from an international expert panel on behalf of the ELN. Blood 140, 1345-1377.
6. Hehlmann R, Voskanyan A, Lauseker M et al. (2020) High-risk additional chromosomal abnormalities at low blast counts herald death by CML. Leukemia 34, 2074-2086.
7. Gong Z, Medeiros LJ, Cortes JE et al. (2017) Cytogenetics-based risk prediction of blastic transformation of chronic myeloid leukemia in the era of TKI therapy. Blood advances 1, 2541-2552.
8. Wang W, Cortes JE, Tang G et al. (2016) Risk stratification of chromosomal abnormalities in chronic myelogenous leukemia in the era of tyrosine kinase inhibitor therapy. Blood 127, 2742-2750.
9. Baccarani M, Castagnetti F, Gugliotta G et al. (2019) The proportion of different BCR-ABL1 transcript types in chronic myeloid leukemia. An international overview. Leukemia 33, 1173-1183.
10. Gong Z, Medeiros LJ, Cortes JE et al. (2017) Clinical and prognostic significance of e1a2 BCR-ABL1 transcript subtype in chronic myeloid leukemia. Blood cancer journal 7, e583.
11. Bidikian A, Kantarjian H, Jabbour E et al. (2022) Prognostic impact of ASXL1 mutations in chronic phase chronic myeloid leukemia. Blood cancer journal 12, 144.
12. Ernst T, Busch M, Rinke J et al. (2018) Frequent ASXL1 mutations in children and young adults with chronic myeloid leukemia. Leukemia 32, 2046-2049.
13. Kim T, Tyndel MS, Kim HJ et al. (2017) Spectrum of somatic mutation dynamics in chronic myeloid leukemia following tyrosine kinase inhibitor therapy. Blood 129, 38-47.
14. Branford S, Apperley JF (2022) Measurable residual disease in chronic myeloid leukemia. Haematologica 107, 2794-2809.
15. Cross NC, White HE, Colomer D et al. (2015) Laboratory recommendations for scoring deep molecular responses following treatment for chronic myeloid leukemia. Leukemia 29, 999-1003.
16. Scott S, Cartwright A, Francis S et al. (2021) Assessment of droplet digital polymerase chain reaction for measuring BCR-ABL1 in chronic myeloid leukaemia in an international interlaboratory study. British journal of haematology 194, 53-60.
17. Hughes T, Deininger M, Hochhaus A et al. (2006) Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 108, 28-37.
18. Branford S, Cross NC, Hochhaus A et al. (2006) Rationale for the recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts in patients with chronic myeloid leukaemia. Leukemia 20, 1925-1930.
19. (GELMC) GEdLMC (2020) Manual Para El Control y El Tratamiento de Los Pacientes Con Leucemia Mieloide Crónica.
20. García-Gutiérrez V, Gómez-Casares MT, Puerta JM et al. (2017) A BCR-ABL1 cutoff of 1.5% at 3 months, determined by the GeneXpert system, predicts an optimal response in patients with chronic myeloid leukemia. PloS one 12, e0173532.
21. Schäfer V, White HE, Gerrard G et al. (2021) Assessment of individual molecular response in chronic myeloid leukemia patients with atypical BCR-ABL1 fusion transcripts: recommendations by the EUTOS cooperative network. Journal of cancer research and clinical oncology 147, 3081-3089.
22. Shanmuganathan N, Pagani IS, Ross DM et al. (2021) Early BCR-ABL1 kinetics are predictive of subsequent achievement of treatment-free remission in chronic myeloid leukemia. Blood 137, 1196-1207.
23. Hanfstein B, Shlyakhto V, Lauseker M et al. (2014) Velocity of early BCR-ABL transcript elimination as an optimized predictor of outcome in chronic myeloid leukemia (CML) patients in chronic phase on treatment with imatinib. Leukemia 28, 1988-1992.
24. Soverini S, Bavaro L, De Benedittis C et al. (2020) Prospective assessment of NGS-detectable mutations in CML patients with nonoptimal response: the NEXT-in-CML study. Blood 135, 534-541.
25. Shah NP, Skaggs BJ, Branford S et al. (2007) Sequential ABL kinase inhibitor therapy selects for compound drug-resistant BCR-ABL mutations with altered oncogenic potency. The Journal of clinical investigation 117, 2562-2569.
26. Khorashad JS, Kelley TW, Szankasi P et al. (2013) BCR-ABL1 compound mutations in tyrosine kinase inhibitor-resistant CML: frequency and clonal relationships. Blood 121, 489-498.
27. Khorashad JS, de Lavallade H, Apperley JF et al. (2008) Finding of kinase domain mutations in patients with chronic phase chronic myeloid leukemia responding to imatinib may identify those at high risk of disease progression. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 26, 4806-4813.
28. Jones D, Kamel-Reid S, Bahler D et al. (2009) Laboratory practice guidelines for detecting and reporting BCR-ABL drug resistance mutations in chronic myelogenous leukemia and acute lymphoblastic leukemia: a report of the Association for Molecular Pathology. The Journal of molecular diagnostics: JMD 11, 4-11.
29. O’Hare T, Zabriskie MS, Eide CA et al. (2011) The BCR-ABL35INS insertion/truncation mutant is kinase-inactive and does not contribute to tyrosine kinase inhibitor resistance in chronic myeloid leukemia. Blood 118, 5250-5254.
30. Gibbons DL, Pricl S, Posocco P et al. (2014) Molecular dynamics reveal BCR-ABL1 polymutants as a unique mechanism of resistance to PAN-BCR-ABL1 kinase inhibitor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 3550-3555.
31. Cortes JE, Hughes TP, Mauro MJ et al. (2020) Asciminib, a First-in-Class STAMP Inhibitor, Provides Durable Molecular Response in Patients (pts) with Chronic Myeloid Leukemia (CML) Harboring the T315I Mutation: Primary Efficacy and Safety Results from a Phase 1 Trial. Blood 136, 47-50.
32. Perrotti D, Jamieson C, Goldman J et al. (2010) Chronic myeloid leukemia: mechanisms of blastic transformation. The Journal of clinical investigation 120, 2254-2264.
33. Watmore AE, Potter AM, Sokol RJ et al. (1985) Value of cytogenetic studies in prediction of acute phase CML. Cancer genetics and cytogenetics 14, 293-301.
34. Branford S, Kim DDH, Apperley JF et al. (2019) Laying the foundation for genomically-based risk assessment in chronic myeloid leukemia. Leukemia 33, 1835-1850.
35. Shah NP, Bhatia R, Altman JK et al. (2024) Chronic Myeloid Leukemia, Version 2.2024, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network : JNCCN 22, 43-69.
36. Ng KP, Hillmer AM, Chuah CT et al. (2012) A common BIM deletion polymorphism mediates intrinsic resistance and inferior responses to tyrosine kinase inhibitors in cancer. Nature medicine 18, 521-528.
37. Nteliopoulos G, Bazeos A, Claudiani S et al. (2019) Somatic variants in epigenetic modifiers can predict failure of response to imatinib but not to second-generation tyrosine kinase inhibitors. Haematologica 104, 2400-2409.
38. Schönfeld L, Rinke J, Hinze A et al. (2022) ASXL1 mutations predict inferior molecular response to nilotinib treatment in chronic myeloid leukemia. Leukemia 36, 2242-2249.
39. Branford S, Wang P, Yeung DT et al. (2018) Integrative genomic analysis reveals cancer associated mutations at diagnosis of CML in patients with high-risk disease. Blood 132, 948-961.
40. Ochi Y, Yoshida K, Huang YJ et al. (2021) Clonal evolution and clinical implications of genetic abnormalities in blastic transformation of chronic myeloid leukaemia. Nature communications 12, 2833.
41. Donato NJ, Wu JY, Stapley J et al. (2003) BCR-ABL independence and LYN kinase overexpression in chronic myelogenous leukemia cells selected for resistance to STI571. Blood 101, 690-698.
42. Loscocco F, Visani G, Galimberti S et al. (2019) BCR-ABL Independent Mechanisms of Resistance in Chronic Myeloid Leukemia. Frontiers in oncology 9, 939.
43. Angelini S, Soverini S, Ravegnini G et al. (2013) Association between imatinib transporters and metabolizing enzymes genotype and response in newly diagnosed chronic myeloid leukemia patients receiving imatinib therapy. Haematologica 98, 193-200.
44. Jaruskova M, Curik N, Hercog R et al. (2017) Genotypes of SLC22A4 and SLC22A5 regulatory loci are predictive of the response of chronic myeloid leukemia patients to imatinib treatment. Journal of experimental & clinical cancer research: CR 36, 55.
45. Soverini S, Martinelli G, Rosti G et al. (2012) Advances in treatment of chronic myeloid leukemia with tyrosine kinase inhibitors: the evolving role of Bcr-Abl mutations and mutational analysis. Pharmacogenomics 13, 1271-1284.
46. Soverini S, Martelli M, Bavaro L et al. (2021) BCR-ABL1 compound mutants: prevalence, spectrum and correlation with tyrosine kinase inhibitor resistance in a consecutive series of Philadelphia chromosome-positive leukemia patients analyzed by NGS. Leukemia 35, 2102-2107.
47. Radich JP (2007) The Biology of CML blast crisis. Hematology American Society of Hematology Education Program, 384-391.
48. Grossmann V, Kohlmann A, Zenger M et al. (2011) A deep-sequencing study of chronic myeloid leukemia patients in blast crisis (BC-CML) detects mutations in 76.9% of cases. Leukemia 25, 557-560.